Los Bioinformadores bioluminiscentes

INTRODUCCIÓN

La mayoría de las células son hábiles en la detección de microambientes químicamente contaminados. Cuando entran en contacto con un agente químico lesivo, los genes promotores transcriben ARW mensajero de proteínas que ayudan a la célula a combatir la lesión o a adaptarse a la sustancia a la
cual ha sido expuesta. Un bioinformador es una célula viva, manipulada por ingeniería genética, para producir una señal en respuesta a un agente ambiental químico o físico específico. En estas células parte de los genes promotores han sido remplazados por genes de reporte que, de la misma manera, con activados en presencia del agente, lo que da lugar a la producción de proteínas informadoras que generan una señaldetectable (figura 1)[1-3]. La señal emitida por el bioinformador es diversa: reacción enzimática, cambio en la coloración, fluorescencia, luminiscencia, señales quimioluminiscentes o electroquímicas. También han resultado atractivos los bioinformadores porque la proteína informadora se modifica para ser expresada en la superficie celular con el objeto de ser reconocida por un anticuerpo monoclonal específico. De esta forma, la presencia de un contaminante en el medio se traduce en una señal inmunológica[4-5]. En la mayoría de los casos, la señal se hace evidente utilizando algún sistema identificador, por ejemplo, al añadir un sustrato a la célula o al activar la señal con alguna fuente de luz externa específica. Sólo en pocos casos la señal es emitida por el bioinformador en sí. La tecnología genética disponible permite aumentar la sensibilidad del bioinformador hacia un cierto agente físico o químico. De la misma manera, la actividad de las proteínas informadoras se puede manipular con el objeto de ampliar su respuesta hacia un gran número de variantes estructurales de un contaminante o, por el contrario, restringir su especificidad hacia unespectro muy reducido. su aplicación en múltiples áreas, incluido el diagnóstico médicoBioinformadores bioluminiscentes
Este tipo de bioinformadores emite una señal luminosa cuando se activa su gen de reporte. Actualmente, su uso es bastante amplio e incluye áreas de interés médico que se describen
en el apartado final del artículo. A continuación se describen los genes de reporte de mayor interés. Sistema genético lux: este sistema genético consiste en cinco genes (luxA, luxB, luxC, luxD y luxE) que codifican la proteína enzimática de la luciferasa, enzima que cataliza las reacciones de emisión de luz visible. De la combinación utilizada de los genes depende el sistema identificador de la señal que se utilice. Los bioinformadores luxAB requieren la adición de un sustrato para completar la reacción. Los bioinformadores luxCDABE poseen un sistema generador de luz completo que no requiere ni la adición de sustratos ni la excitación por una fuente luminosa externa. El más conocido de estos sistemas fue el utilizado para la detección de naftaleno en el medio ambiente. La proteína reguladora denominada NahR activa el promotor Pnah para la transcripción de los genes que codifican las enzimas implicadas en la ruta
metabólica. Mediante manipulación genética fue posible construir un sistema en el que el mismo promotor Pnah dirige la expresión de los genes de reporte lux de la bacteria Vibrio fisheri. Mediante la utilización de esta bacteria como sistema sensor, la presencia de naftaleno en el medio se traduce en una emisión de luz.. Sistema genético luc: la luciferasa cataliza una reacción que produce luz visible en el rango de 550 a 575 nm que requiere la adición de sustrato para que la reacción ocurra.Sistema aequorina: la aequorina es una proteína aislada de manera natural del pez Aequorea victoria. Con la adición
de substratos específicos es posible identificar la emisión de luz azul en el rango de 460 a 470 nm. Es el
modelo más utilizado para la detección de virus y bacterias patógenas. . Sistema GTP: la proteína fluorescente verde (GFP), aislada también del pez Aequorea victoria, produce una señal fluorescente de diversos colores, además del azul, sin adición de substrato exógeno. Sus aplicaciones en las células de mamíferos ha permitido el avance en el conocimiento de la dinámica de varios procesos citoplasmáticos y
de dinámica intracelular.
Inicialmente, los bioinformadores se aplicaron exclusivamente en la detección de contaminantes ambientales pero el hecho de que se puedan insertar genes de reporte en células bacterianas y de mamíferos, ha abierto la puerta para
Circuitos integrados bioinformadores bioluminiscentes
(CIBB)
Una vez que el bioinformador ha identificado un agente físico o químico, ¿cómo "convencerlo" de que se comuniquecon nosotros? Investigadores de la NASA = NationalAeronautics and Space Administration han unido losbioinformadores, bacterias en la mayoría de los casos, a circuitos
electrónicos ensamblados en un chip especial de 2 x 2mm que funcionan no sólo detectando la señal emitida por el bioinformador sino como transductor que convierte la señal
biológica en una señal eléctrica cuantificable; esto ha dado lugar a los CIBB, sistemas de bajo costo, bajo gasto energético, muy resistentes y con la posibilidad de diseñarse para detectar casi todo: cadmio, cromo, cobalto, cobre, proteínas, plomo, mercurio, ultrasonido y radiación ultravioleta, por mencionar algunos[ 2, 5, 9-10). Un CIBB consta básicamente de los siguientes elementos
Un medio que brinde un adecuado suministro de nutrientes
para mantener a las bacterias con vida pero que controle su
proliferación (si cambia el número de células se modifica la
cantidad de luz emitida que corresponde a cada nivel del compuesto
detectado).
Bacterias bioluminiscentes encapsuladas en el medio antes
mencionado para garantizar que sean inmovilizadas cerca
al chip. La cápsula debe contener poros adecuados para que

los agentes que se van a detectar puedan fluir hacia el interior
y, de esta manera, sean detectados por el bioinformador y,
además, tener buena transparencia óptica de modo que si las
bacterias emiten luz, el chip pueda percibirla.
Chip que posee un circuito integrado microluminómetro que
detectaría la señal luminosa y la procesaría para convertir la
señal biológica en una señal cuantificable, al manejar y almacenar
la información derivada de la bioluminiscencia. Se le puede
incorporar un transmisor inalámbrico de frecuencia remota.
Para los investigadores de la NASA es vital el desarrollo de
estos dispositivos. En una nave espacial herméticamente cerrada,
las sustancias producidas en los experimentos científicos
o bioproductos se pueden acumular y constituir un riesgo
para los tripulantes. Además, se piensa que en el futuro se
convertirán en el sistema más barato de inspección tanto en
situaciones comunes, por ejemplo, hongos difíciles de percibir
e implicados en el síndrome de edificios enfermos, así
como en bioterrorismo[5].
El ensayo CANARY, un ejemplo del uso médico de los CIBB
En el ensayo CANARY (Cellular Analysis and Notification of
Antigen Risks and Yields), los linfocitos B fueron modificados
genéticamente para expresar la proteína aequorina, proteína
biolumiscente dependiente del calcio, así como
anticuerpos específicos para patógenos de interés. Cuando
los linfocitos son expuestos a bajas concentraciones de
antígenos del patógeno, en pocos segundos se elevan las concentraciones
de calcio intracelular lo cual provoca la emisión
de luz. Los linfocitos B como bioinformadores son extraordinariamente
rápidos, sensibles y específicos; por ejemplo, las
células diseñadas para la identificación de Yersinia pestis
pudieron detectar menos de 50 unidades formadoras de colonias
UFC, en un tiempo inferior a tres minutos, incluido el
paso de concentración. La probabilidad de detección estuvo
en el rango de 62% para 20 UFC a 99% para 200 UFC, donde
la tasa de falsos positivos fue de 0,4%. Estos ensayos también
se han utilizado para la detección de Escherichia coli en alimentos,
detectando cantidades tan pequeñas como 500 UFC/
g en menos de cinco minutos, incluido el tiempo inicial de
preparación de la muestra. Esto es notable, sobre todo si se
tiene en cuenta que el tiempo empleado en pruebas
diagnósticas para esta bacteria con la técnica de reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) es de 30 a 60 minutos; el
límite de la detección habitual es de 10.000 UFC/g. De la
misma manera, se han realizado ensayos para la detección de
Francisella tularensis, el virus de la encefalitis equina venezolana,
Bacillus anthracis, Salmonella Typhimurium,
Staphylococcus aureus, y se considera que la posibilidad de
crear bioinformadores específicos es infinita. Además de una
favorable relación costo-beneficio, ya que las células pueden
ser utilizadas para millones de ensayos y almacenadas indefinidamente
en refrigeración, los linfocitos B como bioinformadores
representan un método de diagnóstico muy rápido en pacientes
que requieren un tratamiento inmediato[8].
Posibilidades médicas de los CIBB
En la actualidad, se realizan ensayos clínicos utilizando
bioinformadores con los genes de reporte lux que pueden ser
utilizados en la evaluación de la efectividad del tratamiento
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UNIVERSITAS MÉDICA 2005 VOL. 46 Nº 2
antibiótico, pruebas de mutagenicidad, detección de diversos
patógenos, ultrasonido y radiación ultravioleta, relación de
agentes que provocan daño en el ADN y su relación con lesiones
cancerosas y ensayos de toxicidad.
Con el gen de reporte GFP las aplicaciones son bastante
prometedoras. Se han realizado ensayos exitosos para evidenciar
la respuesta de las neuronas del cordón espinal a varios
estímulos; se ha monitorizado la liberación de medicamentos,
incluso quimioterapéuticos, a tejidos y se ha observado la supervivencia
de las células y las interacciones moleculares que
se desencadenan después del tratamiento; se han identificado
con mayor efectividad las células infectadas por el virus de la
inmunodeficiencia humana, y se han estudiado las interacciones
proteína-proteína en células vivas. Gracias a la identificación de
proteínas específicas secretadas por células preneoplásicas en
fluidos corporales, se abre la posibilidad de desarrollar CIBB
que emitan señales en respuesta a dichas proteínas. De esta
manera, las células cancerosas se podrían detectar antes del
desarrollo del tumor, se iniciaría el tratamiento médico y, además
podría evaluarse la efectividad del mismo[ 2, 7, 11].
Finalmente, se encuentra en diseño experimental un CIBB
que responde específicamente a la glucosa, con la idea de ser
implantado en personas diabéticas para el seguimiento de
los niveles sanguíneos de la misma. El chip incluye un
radiotransmisor que permite una comunicación por control
remoto a un sistema que recibiría la señal. Esta tecnología
puede adaptarse a la detección de proteínas tumorales específicas[
2, 7, 11].
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Nerio Ramirez